目的和要求

掌握考馬斯亮藍法測定蛋白質含量的原理和方法。學習分光光度計的原理及使用法。

原理

1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍G250與蛋白質結合的原理，迅速、敏感的定量測定蛋白質的方法。染料與蛋白質結合后引起染料zui大吸收的改變，從465nm變?yōu)?95nm，光吸收增加。蛋白質染料復合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度，zui低檢出量為1μg蛋白。染料與蛋白質的結合是很迅速的過程，大約需2min，結合物的顏色在1h內是穩(wěn)定的。一些陽離子，如K+，Na+，Mg2+，（NH 4 ） 2 SO 4，乙醇等物質不干擾測定，而大量的去污劑如TritonX100，SDS等嚴重干擾測定，少量的去污劑可通過用適當?shù)膶φ斩Ｓ捎谌旧ê唵窝杆?，干擾物質少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應用于蛋白質含量的測定。

操作步驟

一、標準方法

取含 10～100μg蛋白質溶液于小試管中，用雙蒸水或緩沖液調體積到0.1mL，然后加入5mL蛋白試劑，充分振蕩混合，2min后于595nm測定光吸收值。以0.1mL雙蒸水或緩沖液及5mL蛋白試劑作為空白對照。

二、微量蛋白分析法

取含 1～10μg蛋白質溶液，用雙蒸水調體積到0.8mL，加0.2mL蛋白試劑，充分振蕩混合， 2min后于595nm測定光吸收值，以0.8mL雙蒸水及0.2mL蛋白試劑作為空白對照。用不同濃度的蛋白質溶液作標準曲線，以蛋白質濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線作為定量的依據(jù)。

試劑和器材

一、試劑

1.標準蛋白質溶液：可用牛血清清蛋白預先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成1mg/mL的溶液。或根據(jù)牛血清清蛋白的紫外消光系數(shù)A 1% 1cm=6.6來確定。

2.蛋白試劑的配制：稱取100mg考馬斯亮藍G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%（W/V）磷酸，將溶液用水稀釋到1000mL。試劑的終濃度為0.01%考馬斯亮藍G250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。

二、器材

1.72型分光光度計

2.微量注射器

3.試管及試管架

4.刻度吸管